Tipp 35:
"Unblot" im Selbstversuch
Einen Testlauf riskiert

...hat kürzlich Laborjournal-Leser Ralph Schill von der Tübinger Eberhard-Karls-Universität (Tierphysiologisches Institut). Auf Veranlassung unseres Proteinbiochemie-Experten Hubert Rehm übrigens. Der schlug in LJ 12/2001 (Seite 53: "Von Geistern & Gelen") vor, doch mal die "Unblot"-Methode zu verifizieren – eine Art abgekürzter "direkt im Gel"-Westernblot, welche bereits kommerziell vertrieben wird. Schill hat’s also versucht – mit eher ernüchterndem Ergebnis:

"Es war die Neugierde, und die Verheissung, Zeit und Verbrauchsmaterialien zu sparen, die mich dazu bewegten, auch mal Sonntags an der Bench zu stehen und den "Unblot" auszuprobieren.

Ich goss drei 12 %ige Polyacrylamidgele, belud sie mit unterschiedlichen Mengen Gesamtprotein jeweils bekannter Konzentrationen. Nach der PAGE trennten sich die bis dahin gemeinsamen Wege der Gele. Mit der Analytical Biochemistry-Publikation (Desai et al., 2001) in der einen und den Gelen in der anderen Hand, "öffnete" ich die Poren zweier Gele mit Isopropanol,während das andere routinemäßig die Prozedur des Westernblots durchlief.

Die beiden "Unblot-Gele" und die mit horse-Serum geblockte Nitrocellulosemembran wurden mit einem 1. Antikörper (mouse anti-human), anschließend mit einem 2. Antikörper (peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG) jeweils für mehrere Stunden inkubiert. Die einzelnen Waschschritte seien hier nicht extra erwähnt, wurden aber gemäß der Laborroutine und der Publikation ausreichend lange durchgeführt. Für eine "Unblot"-Gelfärbung und die Nitrocellulose wurde 4-Chloro(1)naphthol, für das andere "Unblot"-Gel ein noch sensitiveres Färbekit mit 3, 3´, 5, 5´-Tetramethylbenzidin verwendet.

Dann das ernüchternde Aha-Erlebnis: Beide "Unblot"-Gele zeigten zu meiner Überraschung nicht einmal einen Hauch von blauen Banden, während auf der Nitrocellulose lehrbuchhafte Abbildungen sichtbar wurden. So einfach scheint die "Unblot"-Methode doch nicht zu sein. Mögliche Fehlerquellen? Vielleicht wurden die Poren der Gele nicht weit genug geöffnet, so dass die Antikörper nicht eindringen konnten. Vielleicht müssen auch die Antikörper konzentrierter verwendet werden, was dann allerdings der Materialersparnis entgegenläuft.


Fazit: Nix war’s!

Zugegeben, beim Versuch der direkten Gelfärbung habe ich die Zeit zum Blotten und Blocken gespart – sagen wir alles in allem etwa fünf Stunden. Doch ist es nicht eigentlich das Ziel, eine Bande zu bekommen? Dies klappte bei mir nur über den "Umweg" Nitrocellulose, und mal ehrlich, für ein schönes Resultat macht man ab und zu gerne als letzter das Licht im Labor aus."


Letzte Änderungen: 08.09.2004