Tipp 146:
Selbstgebastelte Minisäulen für die Gelchromatographie

Minisäulen für die Gel-Permations-Chromatographie kann man sehr einfach selbst herstellen. Oliver Weingart zeigt wie‘s geht:

Im Rahmen meiner Doktorarbeit musste ich Phospholipidvesikel mit einem Durchmesser von 50 bis 200 Nanometern von kleineren Molekülen, zum Beispiel Peptiden (1,5 kD) oder Fluorezenzfarbstoffen (0,5 bis1 kD) trennen. Dies war notwendig um freie Peptide und Fluoreszenzmoleküle von denjenigen zu trennen, die während der Liposomenherstellung eingeschlossenen wurden.

Die meisten der hierfür in Frage kommenden Techniken, wie Dialyse, Zentrifugation, oder Filtration, erwiesen sich als unbrauchbar, letztendlich blieb mir nur die Gel-Permeations-Chromatographie als Trennverfahren übrig. Bei dieser füllt man ein Gel aus kleinen Polymer-Kügelchen, zum Beispiel quervernetzter Agarose (Sepharose), in eine Trennsäule. Die Polymer-Kügelchen haben einen Durchmesser von bis zu 50 Mikrometer und bilden ein sehr engmaschiges Netz. Zudem besitzen die Kügelchen eine poröse Oberfläche mit Porengrößen von bis zu 200 Nanometern. Gibt man eine Probe auf das Gel, so diffundieren kleine Moleküle in und durch die Poren der Kügelchen, während große Moleküle oder Partikel seltener in den Poren hängen bleiben. Die großen Partikel wandern entsprechend ungehinderter und somit schneller durch das Gel und treten vor den kleinen Partikeln aus der Säule aus.

Passionierter Bastler

Wer im Labor eine schicke FPLC-Anlage mit fertig-gepackten Gel-Permeations-Säulen stehen hat, kann sich glücklich schätzen. Da ich nicht zu diesen Glücklichen zählte, musste ich mir eine andere Lösung überlegen, um die Gel-Permeations-Chromatographie mit meinen Liposomenvesikeln durchführen zu können. Zwar gibt es inzwischen vorgefertigte Mini- und Micro-Spin-Säulen zu kaufen, wenn man bereit ist dafür zwei bis zehn Euro pro Säule zu berappen. Für einen passionierten Labor-Bastler ist dies aber keine Option. In der nachfolgenden Anleitung zeige ich Ihnen daher wie man mit ein paar Handgriffen und nur wenig Materialeinsatz kleine Micro-Spin-Chromatographie-Säulchen selbst herstellen kann.

Als Material für die Säulen benötigt man: ein 0,5 ml-Eppendorfgefäß (Eppi), ein 1,5 ml-Eppi, eine heiße Nadel (die sollte man nicht in den Finger stechen), etwas Glaswolle, ein bis zwei Milliliter Chromatographiemedium (zum Beispiel Sepharose 4B) und eine Tischzentrifuge für 1,5 ml-Eppis.

Zunächst müssen Sie die „Eppi“-Mini-Spin-Säulen herstellen. Dazu entfernt man den Deckel von einem 0,5 ml-Eppi und schmilzt mit der heißen Nadel ein kleines Loch in den Boden des Reaktionsgefäßes (siehe Bild links unten). Als Trägermaterial kann man herkömmliche Glaswolle verwenden. Diese stopft man in das Eppi, bis man eine feste, ein bis zwei Millimeter starke Glaswolleschicht am Gefäßboden erhält (siehe Bild links unten). Achten Sie darauf, dass keine Glasfasern nach oben oder unten mehr abstehen.

Das so modifizierte Eppi stellt man in das 1,5 ml-Eppi. Dieses dient als Auffangbehälter für die späteren Fraktionen. Es muss dabei nicht unbedingt, wie im Bild oben zu sehen, ein Gefäß mit Schraubverschluss sein. In meinem Fall passte deren Durchmesser jedoch am besten zu den 0,5 ml-Eppis.

Nach diesen Vorbereitungen geht es daran die Minisäulen zu füllen. Dazu verwendet man eine 50 %ige Aufschlämmung (Slurry) des Chromatographie-Mediums in dem späteren Elutionspuffer. So weiß man ungefähr, wie viel Medium nötig ist, um die gewünschte Gelbetthöhe zu erhalten. Bei mir erwies sich eine Befüllung bis zur 600 µl-Marke (ca. 2 mm vom oberen Rand des 0,5 ml-Eppi) als sinnvoll. Dazu füllt man das Eppi schrittweise mit dem Gelmaterial, zum Beispiel Sepharose 4B, lässt eventuell etwas Puffer abtropfen und zentrifugiert den Rest in der Tischzentrifuge ab (10 Sekunden bei 1.500 g). Diese Prozedur wiederholt man, bis die gewünschte Füllhöhe erreicht ist (siehe Bild). Anschließend sollte man nochmals 45 Sekunden zentrifugieren, um den restlichen Puffer aus der Sepharose zu eluieren.

Das Micro-Spin-Chromatographie-Säulchen ist damit schon für die Gel-chromatographie vorbereitet. Auf die fertig gegossenen Säulchen kann man 50 bis 100 µl der Probe (vorsichtig) auftragen. Dabei sollte man darauf achten, dass die Probe vollständig auf dem Gel landet und nicht an der Gefäßwand entlang läuft und die Säule umgeht. Anschließend zentrifugiert man wieder bei 1.500 g für 45 Sekunden und schon ist die erste Fraktion mit den größten Molekülen im 1,5 ml-Eppi. Die aufgefangene Fraktion überführt man zügig in ein anderes Gefäß (eventuell gekühlt). Für die weitere Fraktionierung (Molekülgröße abnehmend) gibt man einfach statt der Probe das gleiche Volumen an Puffer zu und zentrifugiert erneut. Diese letzten beiden Schritte wiederholt man bis die gewünschte Anzahl an Fraktionen erreicht ist.

Wenn man mehrere Auftrennungen parallel durchführt, ist es sinnvoll die Fraktionen auf 96-well Mikrotiter oder 96-well PCR-Platten zu sammeln. Dadurch sind die Fraktionen durchnummeriert und lassen sich für spätere Tests (zum Beispiel ELISA oder Spektrometermessung) einfach mit einer Mehrfachpipette auf eine andere Platte übertragen.

Die Säulchen sind nach meiner Erfahrung bei 4 °C über mehrere Tage haltbar. Da das Medium aber schnell eintrocknet sollte man das Gel einige Male nur mit dem Elutionspuffer hydrieren und zentrifugieren bevor man es wieder benutzt. Will man ganz sicher gehen, dass nicht etwa noch Material vom Laborkollegen auf der Säule von letzter Woche hängt, entfernt man einfach das getrocknete Sepharose-Säulchen und gießt ein neues.

Das Chromatographie-Medium spielt bei dieser Methode eine wichtige Rolle. Da nur kleinste Volumina benötigt werden, kann man zunächst ein Medium testen, dass sowieso schon im Labor verwendet wird. Für die Abtrennung niedermolekularer Bestandteile von Liposomen lieferten bei mir Sepharose 4B, Sephacryl S100HR und S400 ähnliche Ergebnisse. Da Liposomen teilweise unspezifische Wechselwirkungen mit dem Chromatographie-Medium eingehen können, ist es von Vorteil, vor dem Auftragen der Probe eine geringe Menge leerer Liposomen aufzutrennen, um das Gel abzusättigen.

Die selbst gebastelten Micro-Chromatographie-Säulchen kann man auch als Micro-Entsalzungs- oder Micro-Pufferänderungs-Säulchen verwenden. Dafür sollte das aufzureinigende Molekül aber möglichst nicht in der ersten Fraktion von der Säule eluieren.

Will man größere Volumina als 100 µl auftrennen, kann man entweder mehrere Säulchen parallel schalten oder eine „Profiversion“ im 15ml-Falconformat basteln (eine Beschreibung dazu erhalten Sie auf Anfrage).




Schnell und zuverlässig

Meine Liposomen eluierten mit der vorgestellten Methode sehr zuverlässig in den ersten zwei oder drei Fraktionen (bei zwei bis dreifacher Verdünnung). Die niedermolekularen Komponenten tauchen etwa ab Fraktion vier auf (siehe Bild unten). Vergleicht man die in den Liposomenfraktionen enthaltene Fluoreszenz mit einer Kalibrationskurve, kann man errechnen, wie viele Peptide oder Fluoreszenzmoleküle in die Liposomen eingeschlossen wurden.

Je nach Übung, benötigt man zur Herstellung der Säulchen zwischen einer viertel und einer halben Stunde (natürlich kann man auch mehrere auf einmal herstellen). Die Auftrennung von 16 Fraktio-nen dauert etwa 20 bis 30 Minuten.

Oliver Weingart
Institut für Lebensmittelwissenschaten, Ernährung und Gesundheit, ETH Zürich
und Bundesamt für Bevölkerungsschutz, Labor Spiez




Letzte Änderungen: 22.02.2011