Tipp 129:
Nilblau A-Färbung von E. coli-Zellen für die Durchflusszytometrie

Bei der Analyse von Säugerzellen oder der Diagnostik von Blutzellparametern ist die Durchflusszytometrie meist erste Wahl. Es spricht aber auch nichts dagegen, Bakterien und Hefen durch die Düse des Durchflusszytometers zu jagen. Dabei muss man jedoch beachten, dass kleine Verunreinigungen und Partikel im Probenstrom, die eine ähnliche Größe aufweisen wie die Bakterienzellen, die Analyse der Zellen mittels Lichtstreuung oder Beugung stören. Um Bakterienzellen und kontaminierende Partikel eindeutig auseinander halten zu können, färbt man die Zellen meist mit einem Fluoreszenzfarbstoff und regt diesen mit einem Laserstrahl an. Viele Labore nehmen dazu den rot fluoreszierenden Farbstoff R414, den die Zelle in die Membran einlagert. R414 hat jedoch zwei gravierende Nachteile. Zum einen hängt die Aufnahme von R414 in die Membran von der R414-Konzentration ab – letztere muss in allen benutzten Lösungen gleich groß sein, ansonsten wird R414 wieder aus der Membran herausgewaschen – zum anderen ist R414 teuer.

Auch Dirk Betscheider und Joachim Jose vom Institut für Pharmazeutische und Medizinische Chemie der Heinrich Heine-Universität in Düsseldorf verwendeten früher R414 für ihre FACS-Analysen von E. coli-Zellen, die Peptid-Bibliotheken auf der Zelloberfläche präsentieren. Bis sie auf der Suche nach einer R414-Alternative in einem Paper über den Fluoreszenzfarbstoff Nilblau A – den Biowissenschaftler schon länger für die Fluoreszenzfärbung und -Mikroskopie von Polyhydroxyalkanoat-speichernden Bakterien (PHA+-Stämme) nutzen – auf eine Randnotiz stießen. Darin war vermerkt, dass auch die als Kontrollen verwendeten E. coli-Zellen, die keine Polyhydroxyalkanoate produzieren, nach der Anfärbung mit Nilblau A rot fluoreszierten, wenngleich sehr schwach.

Diese kleine Randnotiz war für die beiden der Anlass, ihren (PHA-)-E. coli-Stamm, den sie üblicherweise für ihre FACS-Analysen einsetzten, in Gegenwart von Nilblau A hochzupäppeln. Denn, so ihre Idee, die minimale rote Fluoreszenz von Nilblau A-markierten (PHA-)-Zellen, die für die Fluoreszenzmikroskopie nicht ausreicht, müsste für die Analyse mit dem Durchflusszytometer genügen. Das tat sie tatsächlich, wie Betscheider und Jose in einem Beitrag zu den Notes & Tips der Zeitschrift Analytical Biochemistry berichten (Anal.Biochem. 384 (2009) 194-196). Die zwei Düsseldorfer schickten jeweils 10.000 Nilblau A-markierte und nichtmarkierte Kontrollzellen durch ihren Durchflusszytometer und verglichen die gemessene rote Fluoreszenz. Bei den Nilblau A-markierten Zellen war diese im Schnitt 89-mal höher als bei den Kontrollen. Die Nilblau A-gefärbten Zellen ließen sich also eindeutig von den nichtmarkierten unterscheiden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für den Einsatz von Nilblau A in Durchflusszytometer-Analysen geklärt.

Der Farbstoff musste aber noch einen zweiten Test bestehen. Bei FACS-Analysen färbt man Zellen oft gleichzeitig mit einem Kontroll- und einem zielgerichteten Farbstoff, der zum Beispiel an ein Oberflächenprotein bindet. Ersterer dient dazu, die gesuchten Bakterienzellen aus der Probe herauszufischen. Mit der spezifischen Farbmarkierung kann man dann aus dieser vorsortierten Population gezielt Zellen mit den gewünschten Eigenschaften herauspicken. Damit dies reibunglos funktioniert, dürfen sich die beiden Fluoreszenzfarbstoffe jedoch nicht ins Gehege kommen.

Wie sich Nilblau A in Gegenwart eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffes verhält, untersuchten Betscheider und Jose in einem weiteren Experiment. Sie exprimierten dazu in ihrem (PHA-)-Stamm ein Cathepsin G-inhibierendes Peptid, das die Zellen an die Zelloberfläche schleusen und dort präsentieren. Als zielgerichteten Fluoreszenzfarbstoff verwendeten sie FITC-markiertes Cathepsin G. Wieder analysierten sie jeweils 10.000 dieser Zellen im Durchflusszytometer. Das Ergebnis war eindeutig: E. coli-Zellen, die gleichzeitig mit Nilblau A und FITC-Cathepsin G markiert waren, zeigten im Durchflusszytometer eine 100-fach erhöhte rote Fluoreszenz (Nilblau A) und eine 750-fach erhöhte grüne Fluoreszenz (FITC). Nilblau A störte also weder die Sekretion des Cathepsin G-Inhibitors an die Zelloberfläche noch die Fluoreszenz von FITC-Cathepsin G.

Betscheider und Jose kommen deshalb zu dem Schluss, dass die Nilblau A-Färbung von Bakterienzellen für die Durchflusszytometrie eine einfache und kostengünstige Alternative zu anderen Färbemethoden darstellt.

Harald Zähringer


Letzte Änderungen: 04.05.2009