Tipp 128:
Nachweis kleiner RNAs mit Northern Blot

Bis vor kurzem war der LJ-Autor der festen Überzeugung, dass Northern Blots längst ausgestorben sind. Aber weit gefehlt, Northern Blots sind aktueller denn je.

Schon zur Jahrtausenwende kam ich mir mit meinen Northern Blots, die ich für Expressionsstudien von Hefe-Stressgenen einsetzte, vor wie ein Relikt aus vergangenen Zeiten. Aber totgesagte leben länger und offensichtlich hat die RNA-Interferenz-Forschung dieser alten Methode neues Leben eingehaucht.

Diesen Schluss lässt zumindest das Paper von Gurman Pall und Andrew Hamilton von der Universität Glasgow zu, das diese im Juni letzten Jahres in Nature Protocols veröffentlichten (Nature Protocols, 3:6, 1077-1084). Der Titel ihrer Arbeit lautet schlicht: "Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA."

Tatsächlich machen Northern Blots von kleinen nichtkodierenden RNAs, wie siRNAs und miRNAs, auch in Zeiten von Real-Time PCR, Mikroarrays und Tiefensequenzierung noch Sinn. So kann man auf ihnen zum Beispiel gleichzeitig die reifen etwa 20 Nukleotide langen -miRNAs, als auch deren circa 70 Nukleotide langen Vorläufer erkennen. Hinzu kommt, dass ein Northern Blot zwar etwas länger dauert und nicht zu den empfindlichsten Methoden zählt, dafür aber keine großen Kosten verursacht.

Der Knackpunkt bei Northern Blots mit kleinen RNAs ist die Fixierung der RNA-Schnipsel an die Blotmembran aus Nylon. Bei klassischen Northern Blots mit mRNA ist dies keine große Affäre. Man schiebt Blotmembran samt mRNA bei- 80 ° C in den "Backofen" oder fixiert die mRNA mit UV-Licht an die Nylonmembran. Bei kleinen RNAs funktioniert die erstgenannte Methode überhaupt nicht und die zweite, speziell bei 20 Nukleotiden langen RNAs, mehr schlecht als recht. Andrew Hamilton nervten die unbefriedigenden oder nicht-reproduzierbaren Cross-linking Ergebnisse mit UV-Licht wohl so sehr, dass er sich zusammen mit Gurman Pall eine andere Methode ausdachte.

Dazu stöberten die beiden in der Literatur zu chemischen Cross-linkern und stießen dabei auf die Substanz 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC). EDC wird häufig verwendet um 5'-phosphorylierte Oligodeoxyribonukleotide auf Festphasen zu immobilisieren. Das passte genau zu der Cross-Linking-Strategie von Hamilton und Pall. Ihnen schwebte vor, dass die kleinen RNAs nur mit den 5'-Enden an die Nylonmembran binden und senkrecht zu dieser angeordnet sein sollten. Dies würde der Hybridisierungs-Probe im nachfolgenden Schritt den Zugang zu den kleinen RNAs wesentlich erleichtern.

Pall und Hamiltons Idee funktionierte tatsächlich. Offen-sichtlich verknüpft EDC die 5'-phosphorylierten Enden der kleinen RNAs über eine Phosphoramidat-Bindung mit den Amin-Gruppen der Nylonmembran. Das EDC-Crosslinking verbessert jedoch nur die -Fixierung von kleinen RNAs mit weniger als 40 Nukleotiden nennenswert. Bei RNAs mit mehr als 70 Nukleotiden sei, so Pall und Hamilton in ihrem Paper, das UV-Cross-Linking nach wie vor die Methode der Wahl, weil sie einfacher durchzuführen sei.

Wer sich den Northern Blot kleiner RNAs nach Pall und Hamilton genauer anschauen will, findet im oben erwähnten Nature Protocol Paper eine ausführliche Anleitung, in der die zwei die einzelnen Arbeitschritte, angefangen bei der RNA-Isolierung bis hin zum EDC-Cross-Linking, genau beschreiben.

Harald Zähringer




Letzte Änderungen: 05.03.2009