Tipp 122:
Sensitive Coomassie-Färbung

Erstaunlich, was man aus der guten alten Coomassie-Färbung herausholen kann. Nach ein paar kleinen Änderungen des klassischen Färbeprotokolls kann sie es locker mit der Silberfärbung aufnehmen.


Hallo, liebes Laborjournal-Team

beim Lesen des Artikels "Coomassie ohne Alkohol und Essig" (Laborjournal 3/2008, "Tipps und Tricks", Seite 62) fiel mir auf, dass für die dort beschriebene Coomassie-Färbung keine Detektionsgrenze angegeben wird. Da für die massenspektrometrische Analyse von Gelbanden oder -spots meistens Coomassie-gefärbte Gele nötig sind und bei 2-D-Gelen auch kleinste Proteinmengen analysiert werden, sollte die eingesetzte Coomassie-Färbung am Besten an die Sensitivität einer Silber-Färbung heran reichen.

Wir benutzen deshalb ein modifiziertes Färbe-Protokoll, das auf der von Kang et al. beschriebenen kolloidalen Coomassie-Färbung basiert (Bull. Korean Chem. Soc. 2002, Vol. 23, No. 11). Candiano et al. haben 2004 ein ähnliches Protokoll für die sensitive kolloidale Coomassie-Färbung publiziert, die sie als Blue Silver Staining bezeichneten (Electrophoresis 2004, 25(9):1327-33).

Die Vorzüge der kolloidalen Coomassie-Färbung sind:

• Ein-Schritt-Färbung (Fixierung der Proteine während des Färbens).
• Anfärbung von bis zu 80 % der Proteine innerhalb der ersten Stunde.
• Erreichen der Sättigung nach max. 3 Stunden.
• Kaum Hintergrundanfärbung.
• Minimale und dadurch schnelle Entfärbung.

Im Vergleich zur Blue Silver Färbung setzen wir anstelle von Methanol das weniger giftige Ethanol ein und als Komplexbildner dient Aluminiumsulfat statt Ammoniumsulfat. Zudem verwenden wir weniger Coomassie Blau (CBB G-250) und benötigen auch eine geringere Konzentration an Phosphorsäure. Insgesamt ist die Zusammensetzung also relativ ungiftig (kein Methanol) und der Verbrauch an Chemikalien ist geringer und somit kostengünstiger.

Die Färbelösung setzt sich wie folgt zusammen:

• 0.02 % CBB-G250
• 5 % Aluminiumsulfat-(14-18)-Hydrat
• 10 % Ethanol (96 %)
• 2 % ortho-Phosphorsäure (100 %)

Wichtig! Bei der Herstellung der Lösung diese Reihenfolge beachten: Aluminiumsulfat in H2O lösen. Danach Ethanol zugeben, homogenisieren und CBB G-250 beimischen. Wenn das Aluminiumsulfat gelöst ist, Phosphorsäure hinzufügen. Anschließend mit Reinstwasser auffüllen.

In der resultierenden dunkelgrün-bläulichen Färbelösung schwimmen Farbpartikel (kolloidaler Zustand von Coomassie), die nicht abfiltriert werden sollten. In einer transparenten Flasche ist die Lösung mindestens vier Monate haltbar, in dunklen wahrscheinlich einige Monate länger. Je nach angefärbter Proteinmenge nimmt die Lösung nach der Adsorption an die Proteine in den SDS-Gelen eine tiefblaue Farbe an und die Farbpartikel verschwinden. In diesem Fall kann die Lösung nicht wieder verwendet werden und Sie sollten sie entsorgen.

Als Entfärber verwenden wir:

• 10 % Ethanol (96 %)
• 2 % ortho-Phosphorsäure (100 %)

Alternativ kann man auch mehrmals mit Reinstwasser entfärben.

Für die Durchführung der Färbung sind die nachfolgenden Schritte notwendig:

• Gele nach dem Lauf mindestens zwei mal für 10 Minuten mit Reinstwasser waschen (Das SDS aus dem Laufpuffer verursacht ansonsten einen starken Hintergrund und der Coomassie-Farbstoff bindet nur schwach an die Proteine).
• Coomassie-Lösung vor Gebrauch schütteln; Gele bedeckt unter Schütteln färben.
• Nach 10 Minuten sind die ersten Protein-Spots sichtbar, nach drei Stunden sind die Proteine zu 80 % gefärbt.
• Anschließend die Färbelösung abnehmen (wiederverwenden oder entsorgen) und die Gele zwei mal mit Reinstwasser abspülen.
• Dann 10 - 60 Minuten entfärben und wieder zwei mal mit Reinstwasser waschen.

Kang et al. wiesen mit ihrer Methode noch 1 Nanogramm/Bande Rinderserumalbumin (BSA) nach. Canediano et al. konnten mit dem Blue Silver Protokoll ebenfalls 1 Nanogramm BSA anfärben. Wir selbst detektierten in einer Testreihe mit 1D-SDS-Gelen 2 Nanogramm BSA mit der Kang-Färbung. Sie ist damit ähnlich empfindlich wie die Silberfärbung. Neben dem Paradeprotein BSA haben wir auch die Färbung anderer Proteine getestet und sind mit der erzielten Empfindlichkeit sehr zufrieden. Selbst beim Anfärben von 2D Gelen erweist sich die Kang-Färbung der Silber-Färbung ebenbürtig.

Parallel hierzu haben wir die Kang-Färbung auch mit Färbemethoden verglichen, die Fluoreszenz-Farbstoffe wie Sypro Ruby, Deep Purple oder RuBPS einsetzen. Auch hier schneidet sie gut ab. Sie ist genauso sensitiv oder teilweise sensitiver wie Fluoreszenzfärbungen und ist diesen aufgrund der einfachen Durchführung sowie der kostengünstigen Herstellung klar überlegen. Abgesehen davon kann man Fluoreszenz-gefärbte Gele, im Gegensatz zu Coomassie-gefärbten, nicht subjektiv, sprich visuell beurteilen.

Die Vorteile der Kang-Färbung sind hohe Sensitivität und Farbintensität. Letztere wird durch die geringe unspezifische Hintergrundfärbung und das Neutralisieren in Wasser zusätzlich gesteigert. Das Kang-Protokoll ist deshalb hervorragend für die densitometrische sowie massenspektrometrische Auswertung geeignet. Wir können sie daher als bewährte und sensitive Coomassie-Färbung nur empfehlen.

Nadine Dyballa
(GRK-Doktorandin, Biologisch-Medizinisches Forschungszentrum, Analytisches Zentrallabor, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf)


Letzte Änderungen: 02.05.2008