Viele Arbeitsgruppen können sich ein Leben ohne automatische Pipettierknechte nicht mehr vorstellen und übertragen diesen lästige Pipettierroutinen. Manchmal führt dies zu bösen Überraschungen.
Schallwellen liefern bei akustischen Dispensern die nötige Energie, um feinste Tröpfchen aus Flüssigkeiten herauszuschleudern.
Der entscheidende physikalische Faktor bei der Aufnahme und Abgabe kleinster Nano- oder Mikrolitertropfen mit Liquid-Handlern und Dispensern ist die Adhäsionskraft. Diese sorgt dafür, dass die Flüssigkeitstropfen an Oberflächen kleben wie Kletten. Das ist einerseits sehr praktisch, weil es im Grunde genügt, eine dünne Nadel oder einen Stift in ein Flüssigkeitsreservoir einzutauchen, um eine exakt definierte Flüssigkeitsmenge aufzunehmen.
Das Problem hierbei ist jedoch, den Tropfen wieder vollständig von der Oberfläche herunterzubekommen, um ihn in ein vorgesehenes Gefäß zu übertragen. Die Schwerkraft allein reicht hierzu nicht aus, die Ingenieure müssen schon etwas nachhelfen.
Eine grundlegende Technik, die sie hierzu einsetzen, ist das Kontakt-Dispensieren bei dem der Dispensierstift die Oberfläche des Aufnahmegefäßes leicht touchiert, um den Tropfen auf ihr „abzusetzen“. Ein typisches Beispiel hierfür sind dünne Edelstahlnadeln oder Pintools mit massiven oder eingeschlitzten Spitzen, die winzige Nanoliter-Tröpfchen zielgenau auf den Oberflächen der Zielgefäße platzieren.
Ein kritischer Punkt bei allen Kontakt-Dispensern ist die leichte Berührung der Gefäßoberfläche durch die Spitze des Stifts. Erfolgt diese nicht punktgenau, wird der Tropfen entweder nicht vollständig übertragen oder die Spitze zerstört.
Viele Hersteller favorisieren deshalb kontaktlose Dispensierverfahren für die Konstruktion ihrer Geräte. In diese Kategorie fallen zum Beispiel klassische Liquid-Handler, deren Pipettierköpfe entweder mit fixen, mehrfach verwendbaren Spitzen oder mit Wechselspitzen zum Einmalgebrauch bestückt sind. Spitzenbewehrte Liquid-Handler sind durch die schier unbegrenzte Zahl verfügbarer Spitzen sehr flexibel einsetzbar. Ihr gravierendster Nachteil lässt sich jedoch auch mit den raffiniertesten Tricks nicht ganz beheben: je kleiner die pipettierten Volumina, desto mehr gehorchen sie den Gesetzmäßigkeiten der Mikrofluidik , die mit Pipettenspitzen nicht mehr in den Griff zu bekommen sind. In der Regel ist für Pipettierroboter bei etwa 200 Nanolitern das Ende der Fahnenstange erreicht.
Für das Handling kleinerer Volumina sind kontaktfreie Dispenser, die Piezoelektrische-, Solenoidbasierte- sowie akustische Dispensier-Verfahren nutzen, besser geeignet. Für Furore sorgten in den letzten Jahren insbesondere akustische Dispenser. Was sich zunächst wie Science Fiction anhört, basiert auf einem physikalischen Prinzip, das Akustiker seit gut 100 Jahren kennen: Taucht man eine energiereiche Ultraschallquelle in eine Flüssigkeit, so werden Tropfen aus der Oberfläche herausgeschleudert.
Lange Zeit gelang es den Konstrukteuren jedoch nicht, die Energie der Ultraschallwellen so fein zu dosieren und auf einen Flüssigkeitspunkt zu fokussieren, dass Nano-Tröpfchen mit definierten Volumina entstehen. Der Durchbruch kam erst in den 90iger Jahren, als man auf die Idee kam, die Radiofrequenzen für die Erzeugung der Ultraschallwellen an das akustische Verhalten der Flüssigkeit sowie die Geometrie der Schallquelle anzupassen. Sind diese Parameter richtig eingestellt, so erzeugen akustische Dispensiergeräte Tropfen mit exakt vorgegebenen Durchmessern und damit genau definierten Volumina von wenigen Nanolitern.
Die Nanotröpfchen werden hierbei direkt aus den Wells einer vorbefüllten Mikrotiterplatte in die Näpfchen einer umgekehrt über dieser platzierten leeren Platte geschleudert. Und zwar mit beachtlicher Präzision: der Variationskoeffizient (CV-Wert) liegt beim akustischen Dispensieren unter zwei Prozent.
CV-Werte von zwei Prozent erreichen aber auch spitzenbasierte Liquid-Handler. Es sollte also keinen großen Unterschied machen, ob man eine Verdünnung mit einem Pipettierroboter oder einem akustischen Dispenser herstellt. Hiervon gingen auch Wissenschaftler des Arzneimittelherstellers AstraZeneca aus, die 2010 verschiedene Substanzen auf ihre Wirksamkeit als Inhibitoren des Ephrin-Rezeptors EphB4 testeten.
Pharmakologen beurteilen die Affinität eines Liganden zu einem Rezeptor anhand der halbmaximalen Inhibitionskonstante IC50. Um diese zu ermitteln, verdünnen sie die Testsubstanz schrittweise und setzen sie einem entsprechenden Enzym-Assay zu. Je kleiner der IC50-Wert, den sie hieraus ermitteln, desto stärker inhibiert der Ligand den Rezeptor.
Die AstraZeneca Forscher verdünnten die Testsubstanzen entweder seriell mit einem Pipettierroboter mit fixen Pipettenspitzen oder dispensierten kleine Aliquots mit einem akustischen Dispenser direkt in den Enzym-Assay (direkte Verdünnung).
Theoretisch sollten die ermittelten IC50 Werte für die serielle und die direkte Verdünnung annähernd gleich sein – in der Praxis lagen sie meilenweit auseinander. Die mit dem akustischen Dispenser direkt verdünnten Substanzen lieferten durchweg kleinere IC50-Werte als die seriell verdünnten. Je nach Substanz resultierten aus der direkten Verdünnung 1,5 bis 276,5-mal höhere Affinitäts-Werte als bei der seriellen.
Sean Ekins von der amerikanischen Organisation „Collaborations in Chemistry“ schaute sich diese merkwürdigen Ergebnisse genauer an. Mit zwei Kollegen untersuchte er, wie sich die unterschiedlichen IC50-Werte der beiden Verdünnungsverfahren auf das Modelling von Pharmakophoren auswirkt (Ekins et al., PLoS ONE 8(5): e62325).
Beim Pharmakophormodelling versuchen Pharmakologen die Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptormolekülen, etwa über Wasserstoff- oder Salzbrücken, am Computer zu modellieren. Die hierdurch erhaltenen Pharmakophore sollen ihnen helfen, Inhibitoren mit möglichst hoher Rezeptoraffinität zu konstruieren. Als Ausgangspunkt für die Berechnungen dienen meist Daten bekannter Liganden beziehungsweise Inhibitoren.
Auch hier verwundert es nicht, dass die am Computer konstruierten Pharmakophormodelle völlig unterschiedlich ausfielen, wenn die Forscher von Wirkstoff-Daten ausgingen, die sie nach der direkten oder seriellen Verdünnung ermittelt hatten. Ekins und seine zwei Mitstreiter kommen letztendlich zu dem Schluss, dass nur Assaydaten, die auf der Verdünnung mit dem akustischen Dispenser basierten, vernünftige Pharmakophormodelle lieferten. Die mit dem Liquid Handler erzielten Werte führten hingegen zu völlig irreführenden, wenig brauchbaren Pharmakophoren.
Kein Wunder, dass Ekins 2013 erschienenes Paper in Fachkreisen für Aufruhr sorgte. Foristen und Blogger spekulierten fleißig darüber, warum die zwei Verdünnungsverfahren zu solch unterschiedlichen Ergebnissen führten. Statt seine Zeit mit theoretischen Debatten in Foren und Blogs zu verschwenden, tat sich Ekins mit dem Wirkstoff-Designer John Chodera und dessen Mitarbeiterin Sonya Hanson vom Memorial Sloan Kettering Institut in den USA zusammen und ging der Sache auf den Grund. Ihre Ergebnisse veröffentlichten die drei Ende letzten Jahres im Journal of Computer-Aided Molecular Design (29, 12, 1073-86).
Der Knackpunkt scheint tatsächlich der zufällige Fehler bei jedem Verdünnungsschritt mit dem Liquid Handler zu sein, der sich immer weiter aufsummiert. Bereits bei einer Serie von acht Verdünnungen führt dies zu einer erheblichen Schieflage (Bias) der Substanzkonzentration im letzten Verdünnungsschritt. Die hierdurch zu hoch ausfallenden IC50-Werte täuschen schließlich eine schwächere Affinität des Liganden vor.
Interessant ist, dass der akustische Dispenser unpräziser als der Liquid-Handler arbeitet und seine CV-Werte (für die Konzentrationen im Assay-Volumen) durchgehend größer sind als die des Liquid-Handlers. Entsprechend sind auch die CV-Werte für die halbmaximalen Inhibitionskonstanten etwa zweimal höher. Da dieser Fehler jedoch nicht so stark ins Gewicht fällt wie die durch die Verdünnungsreihe verursachte Bias, sprechen sich Ekins und seine Kollegen dennoch für die Verwendung des akustischen Dispensers aus.
Die genaue Ursache des Fehlers bei der seriellen Verdünnung ist aber auch Ekins und Chodera nicht ganz klar. Mit Verdünnungseffekten allein, etwa durch Tröpfchen, die bei den Waschschritten an den fixen Spitzen des Liquid-Handlers hängen bleiben, lässt sich die Diskrepanz zwischen den beiden Verdünnungsmethoden jedenfalls nicht erklären.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 01/2016, Stand: Januar 2016, alle Angaben ohne Gewähr)
