Die meisten Zellisolierungs-Kits nutzen Permanentmagneten und mit Antikörpern überzogene paramagnetische Kügelchen für die Zellseparation.
Wer einen bestimmten Zelltyp aus einem Gewebe oder Organ isolieren will, muss diesen aus einer wilden Melange unterschiedlicher Zellarten herausfischen. Mit Zellisolierungs-Kits ist dies ein Kinderspiel.
Auch in Zeiten induzierter pluripotenter Stammzellen wissen Lebenswissenschaftler noch immer nicht genau, aus wie vielen Typen von Zellen der Mensch besteht. Fest steht, dass es eine ganze Menge sind. Je nachdem, wie streng die Wissenschaftler die Zugehörigkeits-Grenzen ziehen, schwanken die Angaben zwischen 200 und etwas mehr als 300 verschiedenen Zelltypen (Mr. „Molecular biology of the cell“, Bruce Alberts, liegt mit geschätzten 250 genau dazwischen). Wer daraus einen bestimmten Typ isolieren will, kann auf unzählige kommerzielle Zellisolations- beziehungsweise -separations-Systeme und Kits zurückgreifen, die meist auf Adhäsions-, Dichtegradienten- oder Antikörper-Methoden beruhen.
Adhäsionsbasierte-Trennmethoden sind simpel und billig, dafür hapert es ihnen an Spezifität. Im Grunde verdaut man mit diesen lediglich das Gewebe aus dem die Zellen isoliert werden sollen enzymatisch oder zerkleinert sie mechanisch und plattiert die entstandene Zellsuspension anschließend in einer Kulturflasche oder -schale aus. Die auf der Oberfläche anhaftenden Zellen werden dann weiter kultiviert.
Deutlich saubere Trennungen liefern Dichtegradienten-Techniken, bei denen man die heterogene Zellmischung auf einen zuckerbasierten Dichtegradienten, zumeist aus Ficoll, aufträgt und nachfolgend zentrifugiert. Entsprechend ihrer Dichte sammeln sich die Zellen in unterschiedlichen Zonen des Dichtegradienten und können von dort abgehoben werden. Ein klassisches Beispiel hierfür ist die in klinischen Laboren übliche Blut-Apherese, mit der sich zum Beispiel mononukleäre Blutzellen isolieren lassen, die sich nach der Zentrifugation zwischen Plasma und Ficollphase konzentrieren. Auch hier ist die Spezifität ziemlich mau, der Zeit- und Materialaufwand dagegen relativ hoch.
Wesentlich spezifischer und auch schneller sind Antikörper-basierte Separations-Techniken, allen voran die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS), die den Markt für Zellisolierungs-Kits klar dominiert. Im Gegensatz zur fluoreszenz aktivierten Zellsortierung (FACS) sind für die magnetische Sortierung keine teuren Durchflusszytometer mit angeschlossener Sortiereinheit nötig. Die Isolierung der Zellen findet meist in einem einfachen Eppendorf-Gefäß oder einer kleinen Säule statt.
Das MACS-Grundprinzip ist so einfach wie wirkungsvoll. Winzige Styrolkügelchen mit einem superparamagnetischen Kern aus Eisenoxiden und Durchmessern, die von 50 Nanometern bis zu wenigen Mikrometern reichen, verknüpft man mit einem (Primär)-Antikörper gegen ein spezifisches Zelloberflächen-Antigen der zu isolierenden Zelle. Meist bedient man sich hierzu aus dem riesigen Pool der Cluster of Differentation, kurz CD-Marker, die auf der Zelloberfläche zu finden sind. Die Antikörper-bestückten Beads mischt man mit der Zellsuspension und platziert das Reaktionsgefäß beziehungsweise die Säule anschließend im Magnetfeld eines Permanentmagneten. Zellen, die an Antikörper-Beads binden, werden im Magnetfeld fixiert, während man die nichtgebundenen Zellen absaugen beziehungsweise von der Säule spülen kann.
Dieses Grundrezept haben die Entwickler von Zellisolations-Kits inzwischen in mannigfacher Weise variiert, allein bei den Beads ist die Auswahl kaum noch zu überblicken. Man erhält diese in verschiedenen Größen, mit oder ohne Antikörper-Überzug (gecoated), bestückt mit Streptavidin für die Bindung von biotinylierten Liganden beziehungsweise Sekundärantikörpern oder aber auch versehen mit spezifischen Oberflächenfunktionalitäten.
Auch bei den Verfahren zur Abtrennung der zellbeladenen Beads haben sich die Hersteller einiges einfallen lassen. Neben den klassischen magnetischen Trennmethoden existieren auch Siebverfahren, die mit nicht-magnetischen Beads arbeiten. Die antikörperbestückten Beads mischt man auch hier zunächst mit der Zellsuspension und füllt diese dann auf eine spezielle Filterkartusche. Während ungebundene Zellen den Filter passieren und auf nimmer wiedersehen im Ausguss verschwinden, passen die zellbeladenen Beads nicht durch die Poren des Filters und werden von diesem zurückgehalten. Mit einem entsprechenden Puffer löst man die Zellen anschließend von den Beads und fängt sie nach der Passage des Filters, der die unbeladenen Beads zurückhält, in einem Probenröhrchen auf.
Auf einer Kombination aus Dichtezentrifugation und Antikörperbindung beruht eine moderne Variante der sogenannten Rosettierung. Bei der klassischen Rosettierung mischt man Schaferythrozyten mit humanen Blutzellen, wodurch sich die humanen T-Zellen rosettenartig an die Schaferythrozyten anlagern. Aufgrund ihrer hohen Dichte lassen sich die Rosettenkomplexe mit einer Dichtgradienten-Zentrifugation von den leichteren Blutbestandteilen absondern. Die Rosettenbildung kann man auch erreichen, indem man die zu sortierenden Zellen über geeignete Antikörperkomplexe mit roten Blutzellen vernetzt. Die auf diese Weise negativ selektierten Zellen trennt man nachfolgend in einem Ficoll-Dichtegradienten von den gewünschten ab. Kombiniert man dieses Verfahren mit der MACS-Technik, so kann man die angereicherten Zellen mit den entsprechenden Antikörper-Beads weiter selektieren.
Obwohl allen MACS-Verfahren das gleiche Prinzip zugrunde liegt, können unterschiedliche MACS-Zellisolations-Kits bei gleichen Zelltypen zu verschiedenen Ergebnissen führen. Zu diesem Schluss kommen Markus Olbrich und seine Kollegen vom Universitätsklinikum in Tübingen in einem 2012 erschienen PLoS-Paper (PLoS ONE 7(10): e47176). Die Tübinger isolierten mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus der Kieferknochenhaut (Periost) mit zwei weitverbreiteten MACS-Separations-Kits, die auf den zwei typischen MACS-Varianten basierten: Säule im Magnetfeld sowie Reaktionsgefäß im Magnetfeld und Ausschütten der nichtgebundenen Zellen. Anschließend verglichen sie unter anderem Zellausbeuten, Mortalitätsraten und Zellreinheit der beiden Methoden.
Sehr deutliche Unterschiede traten zum Beispiel bei den Sterblichkeitsraten zu Tage, die bei der Säulenmethode mit rund 42 % wesentlich höher lag als bei der Ausschütt-Variante mit etwa 20 %. Klarer Sieger bei der Reinheit und weiterer für Periost-MSCs ausschlaggebender Parameter, war jedoch die Säulenmethode. Letztendlich kam das Team um Markus Olbrich zu dem Schluss, dass die Säulenmethode für die Isolierung von MSCs aus Periostzellen besser geeignet ist als das Ausschüttverfahren. Und die Moral von der Geschichte? Egal was in Produktflyern und Broschüren der Kits zu lesen ist: Wie gut diese im Einzelfall funktionieren und für welche Zellen beziehungsweise Anwendungen sie am Besten geeignet sind, zeigt sich erst im realen Experiment.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 09/2013, Stand: August 2013, alle Angaben ohne Gewähr)
