Maximal verwerten!

Zellen aus der Prostata

Tanja Schlüter

Vor vier Wochen haben wir in Laborjournal 10/2005 die Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen aus Prostatagewebe beschrieben. Die Vorsteherdrüse hat aber noch mehr zu bieten.

Die Prostata ist der Schrecken von Herren über 60. Zellkultivierer aller Altersstufen hingegen finden die Vorsteherdrüse toll: Nicht nur mikrovaskuläre Endothelzellen kann man aus ihr isolieren - nein, dieses Organ hat noch mehr zu bieten. Sie können auch gezielt auf Fibroblasten und Epithelzellen zugreifen und damit ein In vivo-System bauen.


Feinde werden Freunde

Kurze Wiederholung: Zur Endothelzellzucht wurde die Prostata in etwa drei Millimeter kleine Würfelchen geschnitten, über Nacht im Kühlschrank in einer Dispaselösung inkubiert, und die Stückchen dann mit einer Pinzette vorsichtig ausgedrückt. In der Zellsuspension befinden sich die Endothelzellen. Denen steht allerdings noch ein langer Weg bevor, bis sie reif für Experimente sind.

Da sind Fibroblasten um einiges genügsamer und wachsen zudem um Längen schneller. In der Endothelzell-Reinkultur waren Fibroblasten noch die Feinde des Kulturmenschen. Wenn Sie nun die Fibroblasten kultivieren wollen, benötigen Sie die ausgequetschten Prostatastückchen. Die dürfen Sie also nicht in den Abfall wandern lassen. Zusätzlich benötigen Sie ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen und Kollagenase in der Konzentration 1 mg/ml in Standardmedium (zum Beispiel RPMI 1640) mit 10 % FCS. Kollagenase ist ein proteolytisches Enzym, das die Kollagenfasern in Stützgeweben abbaut, welche wiederum Gewebe und Organe zusammenhalten. Die Prostatastückchen also ins Zentrifugenröhrchen geben, und mit dem doppelten Volumen an Kollagenaselösung auffüllen. Danach das Röhrchen in einen Überkopfschüttler einspannen und bei langsamer Umdrehung über Nacht bei Raumtemperatur drehen lassen.

Keine Prostata-Probleme mehr

Am nächsten Morgen sieht man von den Prostatastückchen nichts mehr. Bis auf ein paar rudimentäre Reste hat die Kollagenase alles verdaut. Die Suspension ist ziemlich zähflüssig, daher muss sie mindestens zehn Minuten bei 400 g zentrifugiert werden, damit sich ein Zellpellet bildet. Den Überstand dekantieren Sie vorsichtig ab, da das Zellpellet nur locker und fluffig im Konus liegt.

Die Kollagenase hat nun alles getan, was sie sollte, sie hat ausgedient und muss weg. Also noch mal mit Standardmedium waschen, um alle Kollagenase-Reste zu entfernen. Danach das Pellet in RPMI mit 10 % FCS aufnehmen, in eine Kulturflasche einsäen und ab in den Brutschrank bei 37 °C und fünf Prozent CO₂. Das wars. Es folgen faule Tage, in denen Sie abwarten, bis sich schöne lang gestreckte Fibroblasten zeigen. Das kann mitunter ein bis zwei Wochen dauern, aber wachsen werden sie, die Fibroblasten, mit nahezu hundertprozentiger Sicherheit.


Ein klitzekleiner Haken

Einen klitzekleinen Haken hat die Sache. Auch wenn Sie sich optisch sicher sind, dass alle Zellen, die Sie in der Kulturflasche erblicken können, Fibroblasten sind, sollten Sie dennoch eine Selektion durchführen. Dies geschieht am besten, indem Sie die Erstaussaat mit Anti-CD90 beschichteten paramagnetischen Beads auftrennen, und zwar so wie es in der letzten Laborjournal-Ausgabe (Heft 10/2005 auf den Seiten 84-85) beschrieben wurde.

Anti-CD90 (Thy-1) ist ein Antikörper, der einigermaßen spezifisch an Fibroblasten bindet. Bei CD90 handelt es sich um ein Glykoprotein der Immunglobulin-Superfamilie. Es wird im Menschen hauptsächlich von Nervenzellen exprimiert, darüber hinaus auf einer Subpopulation CD43-positiver Stammzellen und auf verschiedenen Fibroblasten. Das Fibroblasten-CD90 wird allerdings nur von Antikörpern des Klons AS02 erkannt. Mit Anti-CD90-Antikörpern anderer Klone lassen sich keine Fibroblasten selektionieren.

Auch andere Antikörper, wie zum Beispiel solche gegen Prolyl-4-Hydroxylase, gelten als fibroblastenspezifisch. Prolyl-Hydroxylase ist für die Synthese und Reifung von Kollagentypen notwendig. Die β-Untereinheit von Prolyl-4-Hydroxylase ist ein Molekül, welches normalerweise auf der Oberfläche humaner Fibroblasten sitzt. Allerdings ist dieses Enzym auf den Fibroblasten der Prostata nicht zu finden, und somit sind Antiköper mit dieser Spezifität ungeeignet für die Selektion unserer Fibroblasten.

Erotische Fibroblasten

Wie schon im ersten Artikel erwähnt, liebe ich das Durchflusszytometer. Es hilft uns dabei, zu überprüfen, ob wirklich nur Fibroblasten kultiviert wurden. Wenn Sie gezielt Fibroblasten züchten, werden Sie feststellen: Fibroblasten sind schön. Wie sie da nackt und langgestreckt auf ihrem Substrat liegen! Und sie sind so herrlich unsensibel: man kann sie im Gegensatz zu den meisten Zellen der Primärkultur in einer geringen Zelldichte in einem günstigen Standardmedium aussähen. Sie proliferieren locker vier bis fünf Monate in Kultur und lassen sich in DMSO tieffrieren und wieder auftauen.

Für manche Versuche kann es von Vorteil sein, seine Zellen serumfrei zu kultivieren. Spätestens wenn Sie nach sezernierten Proteinen suchen, werden Sie sich nach serumfreiem Medium sehnen. Damit müssten Sie nämlich nicht mehr mühselig Serumproteine enfernen, die zum Beispiel Endothelzellen zum Überleben brauchen. Fibroblasten sind nun harte Naturburschen, denen eine serumfreie Umgebung wenig ausmacht. Die Poliferationsrate ist zwar nicht so rasant, aber durchaus zufriedenstellend. Verschiedene Firmen bieten auch serumfreie Spezialmedien für Fibroblasten an. Nach unseren Erfahrungen legt man das Geld dafür jedoch besser in Endothelzellmedium an.

Noch mehr Freunde

Endothelzellen und Fibroblasten sind nicht alles, was die Prostata zu bieten hat. Sie enthält auch große Populationen von Epithelzellen. In der Erstaussaat zur Endothelzellzucht bilden die Epithelzellen den überwiegenden Anteil der adhären-ten Zellen. Sie sind kleiner, kompakter und nicht so anspruchsvoll wie Endothelzellen. Außerdem bilden sie auf ihrer Oberfläche das Zell-Adhäsionsmolekül H-CAM aus, auch CD44 genannt.

Wenn Sie die kostbaren Endothelzellen mit CD31 isoliert haben, schwimmen noch eine ganze Menge an CD44-positiven Zellen in der CD31-negativen Zellfraktion. Sie brauchen nur ein paar paramagnetische Beads mit CD44-Antikörpern zu beschichten, diese zu den CD31-negativen Zellen geben, inkubieren, mit Hilfe des NdFeB-Magneten separieren und die geernteten Zellen in hoher Zelldichte in Kulturflaschen mit Spezialmedium einsäen. Dieses Medium für Epithelzellen ist übrigens serumfrei und leider noch teurer als das für Endothelzellen. Die Epithelzellen fühlen sich darin allerdings super, und wenn die Zellen glücklich sind, ist es auch der Kulturmensch.

Nach ein paar Tagen bilden sich gleichförmige Zellkolonien, die sich über mehrere Passagen kultivieren lassen. Die Ephitelzelle ist allerdings ein Gesellschaftstier, wohl fühlt sie sich nur in ausreichender Gesellschaft von anderen glücklichen Epithelzellen. Sie sollten also auf ausreichende Zelldichte achten.


Nutze die Möglichkeiten...

Mit der Ernte von Fibroblasten, Endothel- und Ephithelzellen haben Sie das Organ beinahe komplett verwertet. Das ist auch sinnvoll, denn für die meisten Institute ist es schwierig, an frische Prostata zu gelangen. Höchstens die zunehmende Vergreisung der Gesellschaft und die damit einhergehenden Prostataprobleme könnten hier mit der Zeit Abhilfe schaffen - aber ich fürchte, Ihr Vertrag wird vorher ablaufen.

Eine Möglichkeit, die isolierten Zellarten optimal zu nutzen, bieten Ko-Kulturen. Bei einer Ko-Kultur werden zwei (oder mehr) verschiedenartige Zellpopulationen unter kontrollierten Bedin-gungen kultiviert. Die Zellen tauschen gegenseitig Faktoren wie Wachstumsfaktoren und Zytokine aus. Ein relativ simples Modell ist das Einhängen von Membraneinsätzen in Multiwellplatten. Die Membraneinsätze sind in unterschiedlichen Materialien und Porengrößen erhältlich. Sie haben die Möglichkeit, eine Zellart in die Wells einzusähen und die andere Zellart in den Membraneinsatz. Die Wechselwirkung der Zellen findet dann ohne direkten Zellkontakt statt.

Auf diese Weise können Sie Proliferationsstudien von Endothelzellen in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Fibroblasten und Epithelzellen durchführen. Sie können mit Mikroarrays die RNA untersuchen, mit 2D-Gelen und Massenspektrometern die Proteine, und was Ihre Fantasie, die Restlaufzeit Ihres Vertrages und der Instituts-Etat sonst noch hergeben.



Letzte Änderungen: 10.01.2006