Wozu Primärkulturen?

Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen aus Gewebe

Tanja Schlüter

Für viele Experimente können Sie Zelllinien vergessen. Sie müssen auf Primärkulturen zurückgreifen. Also ran an die Prostata und herzhaft losgeschnippelt. Worauf Sie bei der Isolierung von Endothelzellen achten müssen, steht hier.

Die Liste der Publikationen, in denen Endothelzellen verwendet werden, ist lang. Häufig werden etablierte Endothelzelllinien, oder wenn es eine primär isolierte Endothelzelle sein soll, HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) aus der Nabelschnurvene verwendet.

Endothelzellen sind mehr als lebende Tapeten in blutführenden Röhren. Sie bilden Gefäße, sind parakrin aktiv und beteiligen sich an spezifischen Funktionen ihrer Organe. Daher zeigen Endothelzellen aus unterschiedlichen Organen funktionelle Unterschiede (Blood 1998; 91:3527-3561). Außerdem gilt es zu berücksichtigen, ob die Endothelzellen große Gefäße oder Kapillaren auskleiden. Endothelzelle ist nicht gleich Endothelzelle.



Endothelzellen sind kontaktfreudig

Endothelzellen aus den kleinsten Gefäßen, sogenannte mikrovaskuläre Endothelzellen (MVECs), stellen den größten Teil der Endothelzellpopulation des menschlichen Körpers. Sie stehen in engem Kontakt zum umliegenden Gewebe. Neuere Untersuchungen legen nahe, dass sie parakrin die Organgröße (zum Beispiel der Prostata) regulieren. Für eine Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und umliegendem Gewebe ist es sinnvoll, die Endothelzellen aus den jeweiligen Organen zu untersuchen. Das bedeutet: Primärkultur statt Zelllinie. MVECs aus parenchymatösen Organen wie der Prostata zu isolieren ist aufwendig. Es ist jedoch unerlässlich, um Angiogenese oder Zell-zu-Zell-Interaktionen zu untersuchen, beispielsweise der Rolle der Endothelzellen für die Entwicklung der benignen Prostatahyperplasie auf den Grund zu gehen.

Viel hilft viel

Wie so oft im Leben: bei der Isolierung von Endothelzellen zählt mehr die Masse als die Klasse. Für die Isolierung von MVECs ist mindestens 40 Gramm Prostatagewebe erforderlich. Wichtig: Nur das ganze Organ oder große Stücke eignen sich für die Isolierung der Endothelzellen. Ein Haufen Geschnipsel ist wertlos. Schnipsel sind häufig das Produkt transurethraler Resektionen (TUR). Diese Operation ist beliebt bei gutartiger Prostatavergrößerung. Das Prostatagewebe wird dabei mit einer elektrisch erhitzten Drahtschlinge, einer "Heißen Schlinge", herausgeschnitten, die Prostata endoskopisch durch die Harnröhre hindurch von innen ausgeschält. Die heiße Schlinge brät aber wahrscheinlich die Endothelzellen zu einem Nanoschnitzel, jedenfalls wachsen sie nicht mehr. So also nicht.

Nach der Entnahme des Organs wird es in physiologische Kochsalzlösung gelegt und ins Labor transportiert. Dort schneiden Sie es unter sterilen Bedingungen in kleine Stückchen. Zielgröße sind drei Millimeter Kantenlänge. Achten Sie darauf wirklich zu schneiden und nicht zu quetschen. Die Prostatastückchen geben Sie in eine Petrischale und inkubieren mit einer Enzymlösung. Dispase z.B. löst mikrovaskuläre Endothelzellen besonders leicht aus dem Gewebe, da sie im Gegensatz zu anderen Proteasen wie Trypsin, Collagenase oder Pronase die Zellwände nicht schädigt. Optimal wirkt Dispase in einer Konzentration von ca. 2,4 U/ml in einem Standardmedium wie RPMI1640 oder DMEM mit jeweils 10 % FCS. Inkubiert wird über Nacht im Kühlschrank.

Jetzt wird geknutscht

Der folgende Tag beginnt mit einer Knutsch-Orgie. Mit dem Alfred-Löffel, einem rostfreien Teelöffel mit kleinen Löchern (Marke Eigenbau), einem Mini-Schöpflöffel, werden nach und nach die angedauten Gewebestückchen in eine neue Petrischale mit frischem Medium überführt und dort mit einer gezahnten Kunststoffpinzette vorsichtig ausgedrückt. Auf keinen Fall dürfen die Gewebestückchen zu einer unförmigen Masse gequetscht werden: Knutschen, nicht Quetschen! Letzteres überleben nur Fibroblasten, Endothelzellen hingegen wollen sanft behandelt werden. Die Gewebestückchen also nicht mit der Pinzette zerreiben oder plattdrücken, sondern zartfühlend fünf- bis zehnmal mit der Pinzette drücken. Die ausströmenden Zellen trüben dabei das Medium ein.

Geknutscht wird wie im wirklichen Leben für zwei bis vier Stunden, wobei Sie das Summen der Bench in eine zärtlich-meditative Stimmung lullt. Genießen Sie es, es handelt sich um eine der wenigen erotischen Momente im Leben des Zellkulturforschers. Alles hat jedoch ein Ende, und am Ende dieses Arbeitsschrittes filtrieren Sie die Suspension durch einen 100 µm-Filter und zentrifugieren das Filtrat. Bei 400 g und vier Minuten sedimentieren Endothelzellen und Epithelzellen, Fibroblasten brauchen etwas länger. Mit Glück können Sie die meisten mit dem Überstand dekantieren.

Das Zellpellet mischen Sie kurz in Trypsin auf, denn es soll eine Einzelzell-Suspension entstehen. Die säen Sie ins unglaublich teure, aber unvermeidliche Spezialmedium für MVECs ein. Nur dieses vorgefertigte Spezialmedium ermöglicht eine standardisierte Kultivierung.

Um es vorweg zu nehmen: Serumfrei wachsen MVECs überhaupt nicht. In gewöhnlichen Nährmedien wie RPMI1640 überleben sie bestenfalls ein paar Tage und dies ohne zu proliferieren. Für die Aussaat gilt als Richtlinie: pro 40 Gramm Gewebe eine 75 cm² Kulturflasche. Eine Angabe in Zellzahl pro cm² ist nicht möglich, da die Zellsuspension neben vereinzelten Endothelzellen hauptsächlich Epithelzellen enthält. Die beiden Zelltypen lassen sich im nicht adhärenten Zustand nicht voneinander unterscheiden. Zudem schwimmen in dieser ersten Zellsuspension eine Menge nicht näher zu identifizierender Gewebebestandteile, vulgo Schrott. Inkubiert wird bei 37 °C und fünf Prozent CO₂. Jetzt heißt es Geduld haben! Am Besten wechseln Sie nach 48 Stunden das Medium. Mit etwas Glück können Sie dann schon erste Zellinseln erkennen. Die bestehen allerdings aus Epithelzellen. Sie aber verschaffen unseren MVECs ein angenehmes Milieu. Bei ereichter Konfluenz kommt endlich der entscheidende Schritt: die Isolierung der MVECs.

Die Guten ins Töpfchen....

Die "guten" Endothelzellen trennt man von den "schlechten" Nicht-Endothelzellen mit Hilfe spezifischer Antikörper: Anti-CD31-beschichtete paramagnetische Beads werden auf die adhärenten Zellen gegeben. CD31 ist nicht spezifisch für Endothelzellen, es wird auch von Thrombozyten, B-Lymphozyten und Monozyten exprimiert. Die allerdings überleben nicht im Kulturmedium.

Es werden etwa vier bis fünf Beads pro Zelle, in einem Gesamtvolumen von etwa 3 ml PBS in eine konfluent bewachsene 75 cm² Kulturflasche gegeben. Im Gegensatz zu den Angaben der Hersteller werden die Zellen nach, nicht vor der Inkubation mit den Beads abgelöst. Sie müssen jedoch darauf achten, dass die Beads gleichmäßig verteilt sind. Am Besten gelingt das, wenn Sie alle fünf Minuten die Kulturflasche leicht hin und her schwenken. Inkubiert wird für 30 Minuten im Brutschrank. Die beladenen Zellen lösen Sie mit Trypsin-EDTA ab. Ein Magnet trennt dann die Guten von den Schlechten. Magneten erhalten Sie von den Herstellern der Beads. NdFeB-Magneten (Neodym-Magnet) aus dem Fachhandel funktionieren ebenfalls hervorragend.

Die Guten sähen Sie so dicht als möglich in Kulturgefäße mit Spezialmedium ein, etwa die Zellen aus 40 Gramm Gewebe in eine 25 cm² Kulturflasche mit 5 ml Medium. Danach müssen Sie sich wieder in Geduld üben: Die Zellen sind anspruchsvoll und sensibel. Sie wachsen in den ersten Tagen langsam, tauchen aber dann häufig wie aus dem Nichts in schönen gleichmäßigen Zellnestern auf. Für hochreine MVECs müssen Sie die Reinigungs-Prozedur mit Anti-CD62E beschichteten Beads wiederholen. E-Selektin (CD62) ist ein Adhäsionsmolekül, das aktivierte Endothelzellen nach Stimulation mit TNF α ausbilden. Hohe Ausbeuten an CD62E+ Endothelzellen erzielt man mit 1ng/ml TNF α im Endothelzellmedium nach einer Inkubation von etwa vier Stunden im Brutschrank.

Sind die mühevoll gezüchteten Zellen wirklich Endothelzellen? Das klären Sie mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen von Willebrand Faktor. Gemessen wird oft mit dem Durchflusszytometer.

Länger als acht Wochen leben die MVECs trotz bester Fürsorge nicht. Sie müssen also fix experimentieren. Oftmals geht die Isolierung trotzdem in die Hose, die Erfolgsquote liegt zwischen 30 und 40 Prozent. Klappt es aber, so haben Sie beste Voraussetzungen für originalgetreue In-vitro-Versuche.


Der Feind der Primärkultur

Der größte Feind der Primärkultur von Endothelzellen ist neben den bakteriellen Kontaminationen der Fibroblast. Er taucht oft unerwartet auf, gerade wenn die Experimente endlich beginnen sollten. Sie erkennen die lang gezogenen Zellen auf einen Blick; sie heben sich deutlich von den gleichmäßigen hügeligen Rundungen der MVECs ab. Fibroblasten sind der Albtraum. Die einzige Möglichkeit sie loszuwerden ist die Kulturflasche zu eliminieren - mit den Endothelzellen. Ja, Primärkulturen machen uns zu geduldigen Menschen...



Letzte Änderungen: 18.10.2005