Auf der Suche nach Komponenten und Hierarchien in Signalleitungswegen stellt sich immer wieder die gleiche Frage: Wer interagiert mit wem?
Um diese Frage schneller beantworten zu können, entwickelte Pascal Falter-Braun's Gruppe von der TU München, zusammen mit einem internationalen Forscherteam, die HaloTag-NAPPA-Technik, die frischen Wind in die Protein-Partnerschaftsbranche bringt. Gleichtzeitig macht das neue Verfahren großformatige Protein-Protein-Interaktions-Screens auch für normal-budgetierte Labors salonfähig (Yazaki et al., PNAS 113, 4238-47).
Für ihre HaloTag-NAPPAs kombiniert die Gruppe zwei etablierte Techniken. HaloTags basieren auf kovalenten Bindungen zwischen dem HaloTag-Fusionsprotein und einem künstlichen chemischen Liganden. Ursprünglich wurden sie für Liganden mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften, beziehungsweise Funktionen, konzipiert. Forscher verwenden sie häufig für die Immobilisierung und Aufreinigung sowie Detektion von Proteinen in vivo.
Nucleic Acid Programmable Protein Arrays oder kurz NAPPAs sind Proteinarrays, die man mit Hilfe zellfreier Expressionssysteme und der Antikörper-vermittelten Verankerung von Proteinen auf Objektträgern (Glasslides), aus DNA-Microarrays herstellt.
Mit der HaloTag-NAPPA-Strategie setzen Yazaki et al. sozusagen auf regional erzeugte Produkte. Statt wie bei Standard-Proteinarrays die Proteine erst einzeln herzustellen, aufzureinigen und dann zu fixieren, drucken sie die Bauanleitung für die Proteine direkt auf die Glasplatte. Die Mikroarrays enthalten DNA in Form tausender Open Reading Frames (ORFs). Nach In-vitro-Transkription und Translation entstehen daraus die entsprechenden Proteine.
„Interaktionspartner” beim Job-Speed-Dating auf der Ideen Expo in Hannover. Wie beim „Speed-Dating” von Proteinen mit der HaloTag-NAPPA-Technik dürften auch hier komplementäre Methoden zur Kandidatensuche nicht das Dümmste sein. Foto: Ideen Expo
Für den Produktionsschritt tauchte das Forscherteam die Glasplatten einfach in ein Reaktionsgemisch, das einen Puffer, T7 Polymerase sowie eine kommerzielle Mixtur aus Weizenkeimextrakten enthielt. Die Enzyme in dem Reaktionsgemisch synthetisieren die gewünschten Proteine also direkt vor Ort auf der Glasoberfläche.
Freilich dürfen die Proteine nach der Synthese nicht einfach wegdiffundieren, sondern müssen während ihrer Produktion und den Waschschritten an ihrer jeweiligen Position haften bleiben. Welchen Trick verwendete die Gruppe hierfür? Jede Protein-Bauanleitung enthält neben dem eigentlichen ORF gleichzeitig auch Informationen zur Verankerung des hergestellten Proteins.
Bei der bisher üblichen NAPPA-Technik trugen die in vitro exprimierten Proteine einen C-terminalen GST-Tag, um das Fusionsprotein mit Hilfe eines anti-GST-Antikörpers an die silanisierte Glasoberfläche des Microarrays zu heften.
Das Team um Falter-Braun modifizierte dieses System und tauschte quasi die Fangleine aus. Statt eines GST-Tags tragen die erzeugten Proteine einen HaloTag, der – das ist der eigentliche Trick – eine hohe Affinität zu chlorierten Alkanen hat.
Yazaki und Kollegen druckten zu jedem DNA-Punkt auf dem Glas-Chip auch einen kleinen Chloralkan-Liganden. Aufgrund seiner Lage am N-Terminus entsteht der HaloTag während der Proteinsynthese als Erstes. Noch während die Translation im Gang ist, wird das wachsende Protein über die HaloTag-Chloralkan-Verankerung vor Ort fixiert. Verglichen mit der ursprünglichen, auf einem GST-Tag basierenden NAPPA-Methode, erreicht die Münchner Technik zwei- bis vierfach höhere Proteinmengen.
Die Interaktionsstudien mit dem NAPPA-Array laufen dann wie bei klassischen Protein-Microarrays ab. Man inkubiert den Array zunächst mit dem markierten Protein X, dessen Interaktionspartner gesucht ist. Anschließend wäscht man den Ansatz, um nicht-gebundene Moleküle zu entfernen und ordnet schließlich die detektierten Signale den einzelnen Interaktionspartnern zu. Für die Markierung nutzten die Wissenschaftler einen dreifachen HA-Tag, entsprechend verwendeten sie für die Signaldetektion die Immunhybridisierung mit anti-HA-Antikörper.
Die modifizierte NAPPA-Technik sollte in sämtlichen Organismen funktionieren von denen genügend ORFs vorhanden sind. Das Team um Falter-Braun konzentrierte sich jedoch auf Arabidopsis thaliana. Die Forscher fixierten 12.000 ORFs (die 40 Prozent des Arabidopsis-Genoms repräsentieren) auf kleinen Glas-Plättchen. Bei einem Punktabstand von nur 250 µm ist hierbei selbst die ruhigste Hand überfordert, deshalb übernahm diese Arbeit ein Roboter, der die ORFs in Duplikaten auf die Glasoberfläche spottete.
Mit den fertiggestellten HaloTag-NAPPAs suchten die Pflanzenforscher schließlich die Interaktionspartner von 38 HA-getaggten Transkriptionsfaktoren, mit dem Ziel, diese in ein Interaktom-Netzwerk einzutragen. Die Gruppe verglich ihre Ergebnisse mit bestätigten Interaktionsdaten und fand eine nur mäßige, aber signifikante Übereinstimmung etwa mit Interaktionsdaten die von Yeast-two-Hybrid (Y2H) Assays stammten.
Yazaki et al. vermuten, dass die drei Methoden zur Interaktionsanalyse HaloTag-NAPPA, Y2H sowie Massenspektrometrie verschiedene Datensätze mit wahren Interaktionspaaren detektieren und sich deshalb eher komplementieren als gegenseitig bestätigen. Dagegen war die Korrelation zwischen Interaktionspartnern, die aus HaloTag-NAPPA sowie In-vitro-Pull-down-Experimenten hervorgingen, relativ hoch. Beiden Methoden liegt schließlich auch ein ähnliches In-vitro-Prinzip zugrunde.
Den potenziellen Fehlerquellen von HaloTag-NAPPAs ging die Mannschaft um Falter-Braun systematisch auf den Grund. Während in klassischen Proteinmicroarrays definierte, ähnliche Mengen an Protein gedruckt werden, hängt die Proteinmenge beim HaloTag-NAPPA-Verfahren von der Effizienz der In-vitro-Translation ab.
Stärkere Signale könnten also einfach auf einer höheren Anzahl schwach interagierender Moleküle beruhen und so eine besonders starke Interaktion mit Protein X vorgaukeln. Um dies auszuschließen, bedruckten die Forscher zwei identische Glasplatten. Eine inkubierten sie mit einem DNA-bindenden Farbstoff (PicoGreen), die zweite diente zur In-vitro-Translation und Immundetektion mit anti-Halo Antikörpern. Nach entsprechender Detektion (UV-Fluoreszenz, beziehungsweise Immundetektion des HaloTags) lieferten die einzelnen Punkte in etwa gleich starke Signale. Demnach liegen die meisten Proteine auf dem Chip in ungefähr gleichen Mengen vor.
Was aber, wenn Protein X an der Glasoberfläche haftet, weil es DNA-affin ist? Dann könnten bestimmte Nukleotidsequenzen Signale verursachen, obwohl am jeweiligen Punkt auf dem Chip gar kein interagierendes Protein sitzt. Eine generelle Affinität zu DNA wäre nicht so dramatisch. In diesem Fall würden alle Punkte ein etwa gleiches Hintergrundsignal liefern, beziehungsweise ein ähnliches Muster wie das Pico-Green-Staining ergeben. Doch ORFs enthalten mitunter DNA-Motive, die „ungewollt“ und funktionell irrelevant von Transkriptionsfaktoren als Bindestellen erkannt werden.
Yaziki und Kollegen schauten sich daher die Häufung bekannter Transkriptionsfaktor-Bindemotive in den einzelnen ORFs genauer an. Sie verglichen die Motiv-Dichte mit den Signalintensitäten, die verschiedene HA-getaggte Transkriptionsfaktoren auf dem Microarray ergaben. Für manche Transkriptionsfaktoren gab es eine Korrelation, für andere wiederum nicht. Fazit: Dass die Bauanleitung (DNA) bei der Microarray-Herstellung auf der Glasplatte verbleibt, kann in einzelnen Fällen, insbesondere bei Transkriptionsfaktoren, zu falsch-positiven Signalen führen.
Vielleicht gibt es hier Optimierungspotenzial, zum Beispiel indem die gedruckte DNA nach In-vitro-Translation durch nukleolytischen Verdau beseitigt oder auf anderem Weg unkenntlich gemacht wird. Trivial wäre diese Behandlung vermutlich nicht, denn es bestünde das Risiko dabei die frisch-hergestellten Proteine zu denaturieren.
Die Vorteile der neuen Technologie gegenüber bisherigen Protein-Microarrays liegen vor allem im geringeren Zeit- und Kostenaufwand. Sowohl Proteinproduktion als auch -reinigung entfallen. Außerdem punkten die neuen Chips mit einer längeren Haltbarkeit. Proteolytischer Abbau oder Proteininstabilität spielen keine Rolle. Spätestens seit Ötzi weiß man, dass DNA ein recht robustes Molekül ist, das auch ungekühlt ziemlich lange überlebt. Zwölf Monate sind, laut aktuellem Paper, zumindest kein Problem.
Ob die beobachteten Protein-Protein-Interaktionen überhaupt im biologischen Kontext relevant sind, muss genauso wie bei bisherigen Protein-Microarrays, in unabhängigen Experimenten überprüft werden. HaloTag-NAPPA ist ein reines In-vitro-Verfahren. Es bringt Moleküle in Kontakt, die sich mitunter in einem Organismus nie begegnen würden: Ausschließlich in Blüten exprimierte Proteine können zum Beispiel in natura schwer mit Wurzel-Proteinen interagieren; ebenso wenig wie sekretierte mit Zellkern-lokalisierten Proteinen.
Mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) lässt sich zumindest die Frage des subzellulären Zusammentreffens, und die Möglichkeit einer In-vivo-Interaktion in lebendem Gewebe klären. Bei der BiFC tragen zwei zu testende Interaktionspartner den C- beziehungsweise N-terminalen Teil eines fluoreszierenden Proteins. Nur wenn sie zusammenkommen entsteht ein Signal.
Im Microarray hatten die Pflanzenwissenschaftler für fünf der 38 getesteten Transkriptionsfaktoren eine Interaktion mit PYL6, einem Co-Rezeptor des Pflanzenhormons Abscisinsäure, festgestellt. Die Daten aus den BiFC-Experimenten sprechen für die HaloTag-NAPPA-Strategie: Alle fünf Kandidaten, aber keine Negativ-Kontrolle erzeugten BiFC-Signale, wenn sie mit PYL6 co-exprimiert wurden.
Wie jedes positive Signal nicht zwangsläufig eine biologisch-funktionelle Interaktion bedeutet, ist eine Interaktion bei einem ausbleibenden Signal nicht völlig ausgeschlossen. Durch die Fixierung auf dem Chip, aber auch durch die Fusion an einen Tag, liegen die Proteine in einer nicht-natürlichen Form vor. Protein X würde vielleicht gern an seinen Partner binden, allosterische Zwänge verhindern dies aber.
Dennoch ist das Speed-Dating von Proteinen mittels HaloTag-NAPPA ein revolutionärer Schritt im Protein-Mikroarray-Geschäft, kommt aber, wie die meisten Technologien, nicht ohne komplementäre Methoden aus.