(2. November 2012) Was Liftfahren dem Treppensteigen voraus hat, ist klar: es führt schneller ans Ziel und erfordert weniger Anstrengung. Gleiches sollten kommerzielle Kits im Vergleich mit hausgemachten Protokollen leisten. Im Labor ist allerdings 'der Weg über die Treppe' dennoch öfter der effektivere und billiger ist er in aller Regel sowieso.
Nach diesem Motto stellt die Mikrobiologin Vicki Doronina von der Universität Manchester auf BitesizeBio ein Protokoll für hausgemachte Plasmid-Midipräps vor, welches höhere Ausbeuten an Plasmid-DNA liefert als jeder ihr bekannte kommerzielle Midipräp-Kit und das meist auch noch schneller. Und so geht's:
1) 50 ml selektives Medium mit Bakterien animpfen. Wachsen lassen.
2) Bakterien zentrifugieren, überstand abkippen. Bakterien-Pellet in 2 ml TEG-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0; 2 mM EDTA, 20% Glucose) aufnehmen.
3) 4 ml Lyse-Puffer (0,2 M NaOH; 1% w/v SDS) zugeben, Mischen durch Inversion.
4) 2,5 ml 3 M Natriumacetat pH 5,3 zugeben, Mischen durch Inversion.
5) Für 15 min. bei Höchstgeschwindigkeit (in der Regel rund 4.000 rpm) herunter zentrifugieren. Wenn nach der ersten Zentrifugation noch Eiklar-ähnliche Substanzen im Röhrchen schwimmen und das Entfernen des überstands stören, den Lauf nochmals wiederholen.
6) Den überstand in ein frisches Falcon-Röhrchen überführen, sofort ein gleiches Volumen Isopropanol zufügen, mischen, und wiederum 15 min. lang abzentrifugieren
7) überstand verwerfen, das weiße Pellet mit 70% Ethanol waschen und an der Luft für 15 min. trocken lassen.
8) Das Pellet enthält nun jede Menge RNA. Dieses daher in 0,5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM EDTA pH 8,0), dem 5 µl RNAse A (10mg/ml) hinzugefügt wurden, aufnehmen und für 30 min. bei 37 °C inkubieren.
9) Die Lösung in ein frisches Eppendorf-Tube überführen und solange mit Phenol extrahieren, bis die Trennlinie zwischen der oberen und unteren Schicht klar ist (zweimal reicht in der Regel).
10) DNA präzipitieren und in 300 µl TE-Puffer resuspendieren. Die endgültige DNA-Konzentration liegt in der Regel bei 2-4 µg/µl.
Erstmals beschrieben wurde diese Art der alkalischen DNA-Extraktion in Nucleic Acids Res. 1979 Nov 24;7(6):1513-23.
Was die Autorin allerdings selbst bemängelt, ist der Reinigungsschritt mit Phenol. Schließlich hantiert ein Jeder nur sehr ungern mit der hochgiftigen, ätzenden und mutagenen Flüssigkeit.
Und tatsächlich antwortete ein Leser darauf mit folgender Alternative:
Kürzlich isolierte ich ein Plasmid mit der gleichen Methode nur im Minipräp-Maßstab. Allerdings fügte ich RNase A bereits zum Resuspensionspuffer (Schritt 2) hinzu und verwendete zudem Kaliumacetat anstelle von Natriumacetat, da Kalium die Fällung von SDS verstärkt. Mit diesen beiden änderungen konnte ich die Phenol-Fällung vermeiden und erhielt ein sehr reines Präp (5mg/ml). Eine 1:10-Verdünnung der Probe gab ich zum Sequenzieren und bekam richtig gute Ergebnisse.
Weniger gesundheitsgefährdend ist diese Alternative allemal. Ob sie allerdings dazu ähnlich gute Ausbeuten liefert, muss wohl erst noch unabhängig bestätigt werden.