(30. August 2011) Nur ein bis zwei Prozent der menschlichen Erbsubstanz dienen als Matrize für Proteine. Trotzdem werden 70 bis 90 Prozent der DNA in RNA abgeschrieben. Neben Ribonukleinsäuren, die für die Proteinsynthese benötigt werden – wie tRNA und rRNA – werden auch so genannte nicht-codierende RNAs (ncRNA) produziert. Man unterscheidet dabei kleine und lange ncRNAs: Kleine ncRNAs sind rund 20 Nukleotide lang. Zu ihnen gehören beispielsweise die microRNA und die small interfering RNA, abgekürzt siRNA, die wichtig für die Genregulation sind. Der größte Teil des Genoms wird in über 200 Nukleotide lange ncRNAs übersetzt. Sie sind ebenfalls an der Genregulation beteiligt, übernehmen daneben aber auch andere Funktionen, etwa bei der RNA-Prozessierung oder dem Splicing.
Den Funktionen der ncRNA auf die Spur zu kommen ist ein möglicher Schlüssel zum Verständnis vieler Erkrankungen und Ansatzpunkt neuer Therapien, beispielsweise zur Etablierung neuer Biomarker. Krebszellen etwa zeigen ein völlig anderes ncRNA-Muster als vergleichbare gesunde Zellen, wie Sven Diederichs vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) und dem Pathologischen Institut in Heidelberg zusammen mit seiner Gruppe für Lungen-, Leber- und Brustkrebszellen zeigen konnte. Um die Funktion der einzelnen ncRNAs untersuchen zu können, entwickelten Diederichs und seine Kollegen jetzt eine Methode, mit der sie die Expression der ncRNA gezielt verhindern können (Genome Research 2011, Doi: 10.1101/gr.122358.111).
Sie setzen hierfür kommerziell erhältliche synthetische Zinkfingernukleasen ein, die bestimmte Zielsequenzen in der DNA erkennen und zerschneiden. Während diese Technik bereits erfolgreich zum Ausschalten proteincodierender Gene eingesetzt wird, funktionierte dieses mit ncRNA-codierenden Genen bislang nicht. Denn die Reparaturmaschinerie der Zelle fügt die zerschnittenen DNA-Enden wieder zusammen. Da die Reparatur-Enzyme dabei nicht genau arbeiten, funktioniert das Abschalten proteincodierender Gene trotzdem: Die in die Sequenz eingebauten Fehler zerstören den richtigen Aminosäure-Code und verhindern so die Proteinproduktion.
Bei den ncRNA-codierenden Genen stören die kleinen Fehler in der Sequenz jedoch weniger, da die ncRNAs nicht über Basentripletts in Aminosäuren übersetzt werden. So entsteht nach der Reparatur wieder ein funktionsfähiges Gen, von dem weiterhin ncRNA-Moleküle abgelesen werden können. Daher wandten die Heidelberger Forscher einen raffinierten Trick an: Sie durchtrennten mit Hilfe einer Zinkfingernuklease ein ncRNA-Gen vor der Startsequenz und integrierten an dieser Stelle ein Poly-Adenylierungs-Signal (Poly-A-Signal). „Eine Poly-Adenylierung bewirkt normalerweise die Stabilisierung von mRNA in der Zelle, wenn sie an das Ende der RNA angebaut wird“, erläutert Diederichs. „Platziert man sie jedoch direkt vor einem Gen, führt sie zu dessen Stilllegung.“
Ihr neues Schneidewerkzeug testeten die Heidelberger Forscher an der rund 8.000 Nukleotide langen ncRNA MALAT1 (Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1) in der menschlichen Lungenkrebslinie A549. Die gezielte genomische Integration des Poly-A Signals mittels Zinkfinger-Nuklease führte zu einer vollständigen Unterdrückung der MALAT1-Expression. Die Methode war der zum Vergleich durchgeführten MALAT1-Abschaltung per RNA-Interferenz damit 300-fach überlegen. „RNA-Interferenz schaltet ncRNA in der Regel nicht vollständig aus, da ncRNAs in der Zelle oft in großer Menge exprimiert werden, häufig im Kern vorliegen und Sekundärstrukturen aufweisen“, erklärt Diederichs.
Mit Hilfe der neuen Methode wollen die Krebsforscher künftig genauer untersuchen, welche Rolle die ncRNA etwa bei der Proliferation, Migration und Invasion entarteter Zellen spielt. "Generell eignet sich die neue Methode auch zur funktionellen Untersuchung anderer Fragestellungen in menschlichen Zellen, für die – anders als im Tiermodell – keine Knock-Out-Mutanten zur Verfügung stehen“, sagt Diederichs.
Melanie Estrella
Bild: Dominik Schwarz/photocase.com